利用患者自身免疫系統(tǒng)消滅癌細(xì)胞的免疫療法為推進(jìn)癌癥治療提供了巨大的希望。為了讓身體抵御癌癥，免疫細(xì)胞必須識別、接觸、殺死并最終清除腫瘤細(xì)胞。例如，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 通路抑制劑）和細(xì)胞毒作用誘導(dǎo)劑（CD3xCD19 和赫賽�。┛梢苑乐拱┘�(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)（Wei et al, 2018）。通過設(shè)計(jì)和引入 CAR-T 細(xì)胞來識別和殺死腫瘤細(xì)胞同樣提供了巨大的潛力，目前已有幾種細(xì)胞療法成功獲批上市（Strati and Neelapu, 2019）。而充分了解效靶細(xì)胞的相互作用過程是識別、驗(yàn)證新靶點(diǎn)和細(xì)胞治療方法的關(guān)鍵。

 

       現(xiàn)在賽多利斯提供了一種基于 iQue 高通量流式分析系統(tǒng)和 Incucyte®  活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)的聯(lián)合工作平臺與工作流程，用于全面評估免疫細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)。在這一流程中可同時(shí)利用流式分析獲取表達(dá)譜和細(xì)胞健康標(biāo)記產(chǎn)生關(guān)于細(xì)胞亞型、激活狀態(tài)和生存能力的信息，以及用活細(xì)胞成像分析獲取細(xì)胞相互作用和殺死腫瘤細(xì)胞的過程中的時(shí)間和空間信息。

 

       -具體流程如下

將帶有綠色熒光核標(biāo)記的靶細(xì)胞以適當(dāng)密度種于 96 孔板中。

       加入免疫細(xì)胞活化劑（如 CD3/CD28 Dynabeads），按不同效靶比加入不同密度的免疫細(xì)胞（如 T 細(xì)胞或 PBMC），及細(xì)胞毒/凋亡紅色熒光探針（如 Annexin V）。

       Incucyte® 在所需時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞成像，同時(shí)以適當(dāng)間隔收取微量上清用于高通量流式分析細(xì)胞因子（IFNγ 和 TNFα）。

       完成殺傷實(shí)驗(yàn)后將細(xì)胞消化移入 96 孔 V 型底板，并用 T 細(xì)胞活化檢測試劑盒標(biāo)記 T 細(xì)胞活化標(biāo)志蛋白。

       通過 iQue 高通量流式分析系統(tǒng)對整板細(xì)胞進(jìn)行亞群分析和評估。

 

       細(xì)胞形態(tài)和空間接觸變化

       在活細(xì)胞成像結(jié)果中，與對照組相比可以顯著觀察到 CD3/CD28 Dynabeads 誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中的 PBMC 細(xì)胞活化發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化，提示了免疫細(xì)胞的激活。同時(shí)無論在非貼壁或貼壁共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞體系中，均出現(xiàn)了明顯的效靶細(xì)胞空間接觸的增加。

 

       量化效靶細(xì)胞數(shù)量

       靶細(xì)胞數(shù)量的變化提示了免疫細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用。Incucyte®  成像和 iQue 流式分析都可以提供可靠的靶細(xì)胞量化計(jì)數(shù)結(jié)果，并且具有高度的一致性，均顯示活化的 PBMC 對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生了顯著的殺傷效應(yīng)。

 

       細(xì)胞因子濃度-效靶細(xì)胞計(jì)數(shù)動態(tài)分析

       將由 iQue 量化的不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞因子濃度數(shù)據(jù)與對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的 Incucyte®  圖像表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)起來，可為整個(gè)免疫殺傷實(shí)驗(yàn)動態(tài)過程提供了更深入的洞察力。

 

       不同濃度 CD3 / CD28 Dynabeads 處理組的免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子出現(xiàn)了不同水平的增加，且與 Dynabeads 呈現(xiàn)濃度依賴變化。IFNɣ 水平在實(shí)驗(yàn)開始 24 h 后大幅增加，96 h 后達(dá)到最大濃度。TNFα 濃度增速更快，但在 72 h 達(dá)到最大水平后開始下降。在 48~60 小時(shí)后，效應(yīng)細(xì)胞的增殖水平與細(xì)胞因子濃度呈正相關(guān)。而效應(yīng)細(xì)胞殺傷引起的靶細(xì)胞數(shù)量降低也起始于這一時(shí)間段，靶細(xì)胞數(shù)量降低水平直接與效應(yīng)細(xì)胞活化水平正相關(guān)。

 

       細(xì)胞亞群分析

       在殺傷實(shí)驗(yàn)達(dá)到終點(diǎn)后，每孔細(xì)胞被收集用 iQue 高通量流式系統(tǒng)的 T 細(xì)胞活化試劑盒對 CD4 和 CD8 細(xì)胞上的早期活化（CD69）、中期活化（CD25）和晚期活化（HLA-DR）標(biāo)志分析。CD69 和 CD25 需要單獨(dú)激活 T 細(xì)胞受體（TCR），而 HLA-DR 需要額外的 CD28 或抗原提呈細(xì)胞的共刺激。在未活化的對照組中，亞群分析顯示 CD8 陽性細(xì)胞中 CD69、CD25 或 HLA-DR 陽性細(xì)胞均為低水平。加入 CD3/CD28 Dynabeads 后則引起所有三個(gè)標(biāo)志表達(dá)呈濃度依賴性升高。

 

       總結(jié) 

       在這一聯(lián)合應(yīng)用中，通過 Incucyte®  自動動態(tài)圖像分析功能獲取形態(tài)學(xué)信息和對靶細(xì)胞計(jì)數(shù)，以及 iQue T 細(xì)胞激活和細(xì)胞因子分析試劑盒及 QBeads 用于細(xì)胞因子分析、細(xì)胞亞群分析。在本流程中，免疫細(xì)胞激活、腫瘤細(xì)胞死亡和細(xì)胞數(shù)量量化的形態(tài)學(xué)變化通過 Incucyte® 活細(xì)胞成像系統(tǒng)分析和闡明，而 iQue 高通量流式系統(tǒng)用于分析細(xì)胞因子釋放信息和細(xì)胞亞群。重要的是，Incucyte®  平臺上的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析可以為流式細(xì)胞分析的檢測時(shí)間點(diǎn)選擇提供了可靠的依據(jù)，聯(lián)合應(yīng)用平臺使得兩種技術(shù)的效用實(shí)現(xiàn)了最大化。

 

       -儀器和試劑-

       Incucyte® 活細(xì)胞分析系統(tǒng)

 

       iQue3 高通量流式細(xì)胞儀

 

       T 細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分析試劑盒

 

       Incucyte®  NucLight 慢病毒綠色熒光試劑

 

       Incucyte® Annexin V 紅色熒光試劑